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Aug 19, 2023

Virus

Scientific Reports volume 13, Numéro d'article : 4101 (2023) Citer cet article 1081 Accès 1 Détails Altmetric Metrics L'expression et la purification de la myosine sont importantes pour une compréhension mécaniste de

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 4101 (2023) Citer cet article

1081 Accès

1 Altmétrique

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L'expression et la purification de la myosine sont importantes pour la compréhension mécaniste de la fonction normale et des changements induits par les mutations. Cette dernière est particulièrement importante pour la myosine II des muscles striés, dont les mutations provoquent plusieurs maladies débilitantes. Cependant, la chaîne lourde de cette myosine est difficile à exprimer et le protocole standard, utilisant des cellules C2C12, repose sur une infection virale. Cela demande beaucoup de temps et de travail et est associé à des exigences infrastructurelles et à des risques biologiques, limitant une utilisation généralisée et entravant la génération rapide d'un large éventail de mutations. Nous développons ici une méthode sans virus pour surmonter ces défis. Nous utilisons ce système pour transfecter des cellules C2C12 avec le domaine moteur de la chaîne lourde de myosine cardiaque humaine. Après avoir optimisé les conditions de transfection cellulaire, de culture et de récolte, nous avons caractérisé fonctionnellement la protéine exprimée, co-purifiée avec les chaînes légères essentielles et régulatrices murines. La vitesse de glissement (1,5 à 1,7 µm/s ; 25 °C) dans le test de motilité in vitro ainsi que l'activité catalytique activée par l'actine maximale (kcat ; 8 à 9 s−1) et la concentration d'actine pour une activité à moitié maximale (KATPase ; 70 –80 µM) étaient similaires à ceux trouvés précédemment lors d’une infection virale. Les résultats devraient permettre de sélectionner de nouveaux types d'études, par exemple le criblage d'un large éventail de mutations pour une caractérisation plus approfondie.

Les myosines sont des moteurs moléculaires qui développent la force et le mouvement en interagissant avec les filaments d'actine dans un processus cyclique piloté par le renouvellement de l'ATP. Ce processus est à la base d’une variété de fonctions importantes, telles que la contraction musculaire, la motilité/le développement de la force des cellules non musculaires, le transport intracellulaire de marchandises et la signalisation cellulaire1. Jusqu'à 79 classes2 ont été récemment identifiées dans la superfamille des myosines. Tous sont construits autour d'une chaîne lourde de myosine (CMH ; ~ 90–250 kD) avec un site de liaison à l'actine, un site catalytique ATPase et d'autres éléments importants pour la fonction motrice ainsi que pour la formation de filaments et la liaison du fret. De plus, des chaînes légères, aux rôles stabilisants, modulateurs et régulateurs, sont attachées à chacune des chaînes lourdes. Pour mieux comprendre les mécanismes de base de la fonction motrice de la myosine, mais également pour des études détaillées des mutations pathogènes, il est important de pouvoir exprimer et purifier tous les composants protéiques mentionnés.

Le système le plus utilisé pour exprimer et purifier les protéines repose sur E. coli comme hôte d'expression, ce qui entraîne des rendements de purification élevés (si le produit d'expression est soluble) ainsi qu'une main d'œuvre et une rentabilité élevées3. Cependant, le système procaryote ne dispose pas d'une machinerie cellulaire complète pour faciliter le repliement approprié et la modification post-traductionnelle des protéines eucaryotes. Alors que l’expression et la purification des chaînes légères fonctionnelles de la myosine sont possibles à l’aide d’E. coli, les chaînes lourdes de la myosine (CMH) ne peuvent pas être produites sous forme fonctionnelle à l’aide de ce système4. Par conséquent, divers systèmes d’expression et de purification eucaryotes basés sur le Dictyostelium5,6,7, la Drosophila melanogaster8, les cellules d’insectes9,10,11,12,13,14 et les cellules de mammifères15,16 ont été développés. Bien que ces systèmes fonctionnent bien pour la production d'une variété de classes de CMH, ils ont eu un succès limité avec les myosines des muscles striés des vertébrés, probablement en raison de l'incapacité d'inclure toute la machinerie de repliement des protéines des cellules musculaires. Bien qu'un certain nombre d'articles aient identifié UNC-45 comme chaperon impliqué dans le repliement de la myosine et l'assemblage des sarcomères20,21,22,23,24, d'autres facteurs semblent être impliqués, tels que Hsp70/Hsp9025 et la chaperonine26. Conformément à ce point de vue, Winkelmann et ses collègues ont présenté la preuve que le repliement approprié des myosines des muscles striés sous une forme pleinement fonctionnelle ne se produit que dans un environnement différencié de type musculaire, c'est-à-dire les myotubes musculaires27,28,29. Sur la base de cette idée, des myoblastes de souris C2C12 qui se différencient en myotubes ont été introduits comme lignée de cellules hôtes d'expression de choix . Les myoblastes ont été transfectés avec des plasmides portant le CMH du muscle squelettique embryonnaire de poulet sous un promoteur, ce qui garantit que l'expression du CMH ne commence qu'après la différenciation en myotubes. Le rendement de purification était suffisant pour évaluer la fonction de la myosine sur la base de l'activité ATPase activée par l'actine. La génération de lignées cellulaires stables27 dans cette première version du système d’expression et de purification basé sur C2C12 (« système basé sur C2C12 » à partir d’ici) offre des rendements de purification relativement élevés avec un flux de travail rentable en termes de temps et de coûts éliminant les cycles de transfection. Cependant, le développement d'une lignée cellulaire stable peut nécessiter jusqu'à 12 mois30 et ne constituerait pas la meilleure approche pour examiner plusieurs constructions différentes (par exemple des mutations ponctuelles) d'une myosine particulière. En revanche, l’expression transitoire offre l’avantage d’un temps de développement court et d’un renouvellement rapide30. Ainsi, le système basé sur C2C12 a ensuite été modifié en utilisant l’expression transitoire d’adénovirus pour introduire et étudier l’impact des mutations ponctuelles de la myosine associées aux cardiomyopathies hypertrophiques31. Le même système a été optimisé par Resnicow et al.32 pour permettre la production de quantités suffisantes de CMH pour l'analyse cinétique transitoire des isoformes de myosine squelettique et cardiaque humaine recombinante33,34,35. Il convient de noter que des activités ATPase considérablement plus élevées ont été obtenues pour la myosine β-cardiaque de type sauvage (WT) et mutante dans ces études que dans un rapport précédent19 dans lequel des mutants de myosine β-cardiaque humaine étaient exprimés et purifiés à partir de cellules d'insectes. Actuellement, l’infection des myotubes C2C12 par adénovirus permet la production de quantités suffisantes de myosines musculaires striées correctement repliées et fonctionnelles (constructions de type S1 et HMM) pour des études fonctionnelles critiques, entre autres, des tests de motilité in vitro et des cinétiques de solutions biochimiques transitoires .